Hladi naj bodo! Postopek izdelave kompetentnih celic je zahteven zaradi potrebe, da celice ostanejo hladne. To je ključnega pomena, ker so celice tako občutljive in krhke, medtem ko so kompetentne Ohranjanje nizke temperature pomaga preprečiti smrt celic med obdelavo.
Zakaj so reakcije med poskusom transformacije obdržane na ledu?
Mešanica plazmidnih celic se nato za kratek čas segreje na 45–50°C, kar omogoča, da DNK vstopi v celico skozi porušeno membrano. Ogreto zmes nato postavimo nazaj na led , da zadržimo plazmide znotraj bakterij … Če ima raztopina plazmidne DNK preveč soli, lahko pride do obloka, ki ogrozi transformacijo.
Zakaj postavite cevi na led?
Zakaj mislite, da smo cevi postavili na led? Da bi dobili DNK v bakterije, moramo v njih narediti luknje s kemikalijo kalcijevega klorida (CaCl2). … Luknje, ki so bile nabodene, da omogočijo DNK, pustijo, da bakterije puščajo. Če jih ne obdržimo na ledu, bodo 'izkrvaveli' do smrti.
Kakšna je vloga ledeno hladnega kalcijevega klorida pri pripravi kompetentnih celic?
Proces transformacije kalcijevega klorida s toplotnim šokom spodbuja bakterijske celice, da prevzamejo DNK iz okolice. … Ledeno hladna raztopina CaCl2 olajša vezavo DNK na površino celice, ki nato po kratkem obdobju toplotnega šoka (3) vstopi v celico.
Kako shranite kompetentne celice?
Kompetentne celice je treba shranjevati pri - 80°C. Shranjevanje pri -20°C bo povzročilo znatno zmanjšanje učinkovitosti transformacije (TE). Pri testiranju na NEB 5-alpha Competent E. coli (NEB C2987H) so celice izgubile 94,5 % TE po samo 24 urah shranjevanja pri -20°C.
